چهارشنبه 20 بهمن 1395

عنوان طرح / پروژه :‌ تعیین خط شناسه مولکولی جلبک Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing 1846 دریاچه سد ارس با استفاده از ژن ITS-2

شماره مصوب یا کد پروژه : 93116-12-79-4 واحد اجرا : مرکز تحقیقات آرتمیای کشور محل اجرا : مرکز تحقیقات آرتمیای کشور- سد ارس نام مجری :فریدون محبی سال شروع :1393 خاتمه : 94/8/28
وضعیت اجرا شده | پروژه های خاتمه یافته | بازدید: 1581 مرتبه | 0 نظر

اهمیت و ضرورت:

یکی از مهمترین موجودات زنده در اکوسیستم های آبی فیتوپلانکتونها هستند. وجود فیتوپلانکتونها اغلب رشد، ظرفیت تولید مثل و خصوصیات جمعیتی سایر موجودات آبزی را تحت تاثیر قرار می دهد (Mohsenpour et al., 2010). تغییرات در اجتماعات فیتوپلانکتونی در یاچه های آب شیرین شاخص خوبی از حالت تروفی و کیفیت زیست محیطی سیستم محسوب می شود (Reynolds, 1996).

سیانوباکتریوم Microcystis aeruginosa گونه ای غالب در اجتماعات فیتوپلانکتونی آبهای شیرین محسوب می شود (Mur, 1983). زمانی که شرایط محیطی برای رشد این گونه مناسب باشد (دمای بالا و پایداری فیزیکی آب) شکوفایی آن رخ می دهد که این حالت در دریاچه سد ارس مشاهده می شود. یکی از دلایل عمده شکوفایی و رشد بیش از حد این گونه در دریاچه های پشت سدها افزایش جمعیت و ورود فاضلاب به آنها می باشد. بعبارت دیگر فعالیت انسانی باعث تخلیه مقادیر زیادی از مواد غذایی به داخل آب پشت سد ارس می‌گردد که رشد و تکثیر فیتوپلانکتونها را تحت تأثیر قرار داده و کیفیت و کمیت جمعیتهای آنها را دچار تغییر می‌نماید و یکی از عوامل بروز شکوفایی جلبک M.aeruginosa می باشد. سد ارس بر روی یکی از بزرگترین رودخانه های حوزه آبریز دریای خزر ساخته شده و از نظر شیلاتی، تامین آب آشامیدنی، تفریح و غیره اهمیت زیادی برای ساکنان منطقه دارد. شناخت اکوسیستم آن و شناسایی جمعیت های تشکیل دهنده میکروسیستیس می تواند مقدمه ای برای از بین بردن یا کاهش رشد بیش از حد این گونه سمی باشد.

اهداف و روش تحقیق :

اهداف طرح:

1- تعیین خط شناسه (بارکدینگ) جلبک میکروسیس تیس

2- ثبت ژن ITS2 جلبک میکروسیس تیس در بانک ژن بین المللی ncbi

در این مطالعه ابتدا پس از تعیین ایستگاههای نمونه برداری عملیات نمونه برداری به صورت فصلی آغاز خواهد شد. کار شناسایی و شمارش فیتوپلانکتونها بوسیله میکروسکوپ اینورت Nikon TS100 با روش Utermohl (1958) انجام خواهد شد. نمونه های جلبک Microcystis در فصلهای تابستان و پاییز برداشت خواهد شد. عوامل فیزیکی آب مثل دما، pH، DO، شفافیت، TDS، توسط دستگاه اکسی متر قابل حمل در حین نمونه برداری انجام خواهد شد. برای شناسایی مورفولوژیکی جلبک میکروسیستیس از کلیدهای شناسایی معتبر نظیر Prescott (1962) ,Tiffany and Britton (1971) Bellinger (1992) و Smith (1950)استفاده خواهد شد. برای بررسی جمعیت های جلبک Microcystis علاوه بر روشهای مورفولوژیکی از روش مولکولی ITS2 استفاده خواهد شد.

جهت بررسی مولکولی در هر ایستگاه حدود 100 لیتر آب از فیلتر 50 میکرونی عبور داده شده و در یک ظرف یک لیتری تغلیظ خواهد شد. در آزمایشگاه زیرنمونه های 100 میلی لیتری دوباره از فیلتر 100 میکرونی عبور داده شده و کلنی های میکروسیس تیس چندین با با آب شسته شده و در لوله های اپندورف غلیظ و در دمای c °25- نگهداری خواهند شد. برای خالص سازی جلبک میکروسیس تیس آنرا بر روی محیط کشت جامد آگار محتوی محیط BG-11 استفاده می شود. استخراج DNA طبق پروتکل Humbert and Le Berre (2001) انجام خواهد شد. بطور خلاصه پس از سانتریفوژ کردن کلنی ها در 750 میکرولیتر بافر لیزکننده سلولی بمدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه خواهند شد. سپس 5 میلی گرم پروتئیناز اضافه و لوله ها در طول شب در دمای 40 درجه گذاشته خواهند شد. سپس استخراج با فنل-کلروفرم و رسوبدهی با اتانول DNA خالص بدست خواهد آمد. DNA استخراج شده تا هنگام استفاده در دمای c°40- نگهداری خواهد شد. ژن ITS2 در هر نمونه DNA توسط PCR(polymerase Chain Reaction) تکثیر می شود. L µ 25 از مخلوط PCR حاوی ng 60 از DNA الگو، Mµ 120 از هر چهار نوکلئوتید dNTP، 10× بافر واکنش PCR ( mM 5/1 Mgcl2، mM50 Kcl، mM 10 Tris-Hcl ; pH 9)، mM 1 از هر پرایمر (forward primer : 5¢-TGT AAA ACG ACG GCC AGT CCA TGG AAG YTG GTC AYG-3¢; reverse primer : 5¢-CCT CTG TGT GCC TAG GTA TCC-3¢), و U 5/1 از آنزیم Taq DNA پلی مراز خواهد بود. DNA های الگو و یک نمونه شاهد منفی در معرض یک مرحله اولیه دناتوراسیون بمدت 1 دقیقه در دمای C° 94 قرار خواهد گرفت. 37 چرخه بعدی شامل یک مرحله 50 ثانیه ای دناتوراسیون در دمای C° 92 ، یک مرحله اتصال 50 ثانیه ای در دمای C° 57 و یک مرحله تکثیر 50 ثانیه ای در دمای C° 72 خواهد بود. یک مرحله نهایی تکثیر 10 دقیقه ای در دمای C° 72 انجام خواهد گرفت. تکثیر نواحی هدف بوسیله آلکتروفورز روی ژل آگارز 5/1% رنگ آمیزی شده با ژل رد (Gel Red) مورد بررسی قرار خواهد گرفت. محصولات PCR در حامل PGEM-T (به نسبت 1:1 محصولات PCR به حاملها) کلون خواهند شد.

حداقل تعداد 10 کلنی به صورت تصادفی از هر مجموعه کلونها انتخاب و رشته های ITS2 آنها بوسیله PCR و با استفاده از پرایمرهای T7 و SP6

T7 (5¢-TAC GAC TCA CTA TAG GGC GA-3¢) and SP6 (5¢-TAG GTG ACA CTA TAG AAT AC-3¢)

تکثیر خواهند شد. تکثیر نواحی هدف بوسیله الکتروفورز روی ژل آگارز 5/1% رنگ آمیزی شده با ژل رد مورد بررسی قرار خواهد گرفت. محصولات PCR قبل از سکانسینگ خالص سازی خواهند شد. پس از انجام سکانسینگ، رشته های DNA بطور مستقل در هر دو رشته انتخاب خواهند شد. جهت آنالیز بهتر تنها سکانس هایی انتخاب خواهند شد که 95%< تشابه با سکانس های Microcystis aeruginosa، M. wesenbergii، M. ichthyoblabe و M. viridis موجود در بانک ژن دارند. رشته های نوکلئوتید بدست آمده در بانک ژن کدگذاری و ثبت خواهد شد. همچنین داده های حاصل به روشهای Neighbor Joining (NJ)، حداکثر صرفه جویی و حداکثر احتمال با استفاده از نرم افزار PHYLIP مورد آنالیز قرار خواهد گرفت.

نتایج :

از تعدادی از نمونه های آب تهیه شده با شماره های 2، 3، 4، 5، 6، 11، 12، 15، 16، 18 نمونه هایی مشابه با مورفولوژی جلبکهای تک سلولی Microcystis جدا شد. با توجه به سایز بسیار کوچک این جلبکها و احتمال اشتباه در شناسایی این جلبکها تکنیک مولکولی برای شناسایی آنها بکار رفت.

انجام الکتروفورز با استفاده از پرایمرهای اختصاصی سیانوفیسه توانست وجود جلبکهای سیانوفیسه در نمونه های ایزوله شده مورد تائید قرار دهد. در راستای بررسی تنوع نوکلئوتیدی باندهای حاصل ژل الکتروفورز DGGE انجام شد. همچنین به منظور تائید صحت باندهای حاصل از تکرارهای فوق تعیین توالی باندهای حاصل در 10 نمونه صورت پذیرفت. نتایج این بررسی نشان دهنده وجود 3 گونه از جلبکهای سیانوفیسه در بین نمونه ها بود که از نظر ژنتیکی اختلاف زیادی با گونه های شناخته شده در بانک ژنی بودند.

دستور العمل فنی و توصیه ترویجی :

1- بررسی سیانوتوکسین های (میکروسیستین) احتمالی موجود در آب دریاچه سد ارس

2- ثبت توالی های ژنی جدید در سایت بانک ژنی nbci

3- مطالعه شکوفایی جلبک میکروسیستیس در اکوسیستم های آب شیرین دیگر کشور

4- شناسایی تاکسونومیکی (مورفولوژیکی و مولکولی) جمعیت های میکروسیستیس در اکوسیستم های آب شیرین کشور

5- شناسایی گونه های میکروسیستیس از نظر تولید یا عدم تولید میکروسیستین در اکوسیستم های آب شیرین کشور

ویژگی مناطق کاربرد توصیه ترویجی :

دریاچه های پشت سدها که دارای آب شیرین بوده و کارایی هایی نظیر تامین آب آشامیدنی، کشاورزی، شیلات و تفریحی دارند و دراکثر مناطق کشور مخصوصا مناطق معتدله که دارای چهار فصل آب و هوایی مشخص و تناوب و توالی فصلی از نظر اجتماعات فیتوپلانکتونی قرار دارند.

گزارش پروژه
مشخصات پیمانکار
مشخصات همکاران
اهداف طرح
زمانبندی طرح
روش تحقیق و اجرا
اطلاعات جغرافیایی
هزینه های اجرای پروژه
نتایج