یک شنبه 8 اسفند 1395

عنوان طرح / پروژه: پایش عوامل میکروبی آب (باکتری، ویروس و قارچ) در تولید میگوی عاری از بیماری خاص

شماره مصوب: 9101k-91001-9104-12-80-14 واحد اجرا: پژوهشکده میگوی کشور محل اجرا: استان بوشهر نام هماهنگ کننده/مجری مسئول/ مجری: بابک قائدنیا سال شروع: 1391 سال خاتمه: 1393
وضعیت اجرا شده | پروژه های خاتمه یافته | بازدید: 1419 مرتبه | 0 نظر

اهمیت، ضرورت، اهداف و روش تحقیق:

در دو دهه اخیر، بیماری به یک معضل اساسی در صنعت پرورش میگوی تبدیل شده است. به ویژه از زمان ظهور بیماری لکه سفید، تولید میگو به میزان معنی داری در بسیاری از کشورها از جمله ایران کاهش یافت و ادامه این صنعت با دشواری های زیادی مواجه شد. نتیجه آن ضربه به اقتصاد، به ویژه تاثیر قابل توجه بر اقتصاد ملی و وضع معیشت بخشی از جمعیت فقیر و دهک های پایین جامعه بود. به عنوان مثال صادرات میگو در اکوادور در دسامبر 1999 به سطحی پایین تر از سال 1985 رسید. برای مقابله با چنین شرایطی همکاری و مراقبت مناسب و به هنگام مورد نیاز بود. چنین مراقبتی به توسعه ایمن صنعت پرورش میگو، ایجاد درآمد ملی از طریق بازرگانی در این حوزه (چه در سطح منطقه‌ای و چه در سطح بین المللی) و بهبود معیشت مزرعه‌داران و دیگر دست اندرکاران این بخش کمک کرد.

مدیریت وحفظ کیفیت آب در استخرهای پرورش میگو و همچنین مدیریت غذا و غذادهی به طور گسترده‌ای به هم وابسته و دارای اثرات متقابل بوده و در تولید پایدار میگوی پرورشی و در آمدزایی آن نقش اساسی ایفا می‌نمایند. گام نخست در موفقیت پرورش آبزیان به مدیریت بهداشتی آن بستگی دارد. در پرورش میگو بهترین، آسانترین وکم‌هزینه ترین روش برای پیشگیری از بیماری‌ها، انتخاب محل مناسب، آماده‌سازی صحیح استخر و پایش و بهبود کیفیت آب است. انتقال بسیاری از عوامل بیماریزا از طریق آب انجام می گیرد، بنابراین تأمین آب عاری از این عوامل، مهمترین راهکار در جلوگیری از ورود عوامل بیماریزا به سیستم‌های پرورش آبزیان می باشد. این مهم در فرآیند تولید میگوی عاری از بیماریهای خاص، اهمیت ویژه‌ای می‌یابد.

· تعیین فراوانی باکتریایی در آب ورودی سیستم تکثیر و استخرهای پرورش میگوی عاری از بیماری خاص

· تعیین فراوانی فارچی در آب ورودی سیستم تکثیر و استخرهای پرورش میگوی عاری از بیماری خاص

· تعیین فراوانی باکتریهای خانواده Vibrionaceae در آب ورودی سیستم تکثیر و استخرهای پرورش میگوی عاری از بیماری خاص

· تعیین فراوانی قارچ های Fusarium spp. در آب ورودی سیستم تکثیر و استخرهای پرورش میگوی عاری از بیماری خاص

استان بوشهر در جنوب غربی کشور و در فاصله 27 درجه و 17 دقیقه تا 30 درجه و 17 دقیقه عرض جغرافیایی و 50 درجه و 8 دقیقه تا 52 درجه و 58 دقیقه طول جغرافیایی واقع شده است. این استان از شمال به استان خوزستان و کهکیلویه و بویراحمد، از جنوب خلیج فارس و استان هرمزگان، از شرق به استان فارس و از غرب به خلیج فارس محدود می شود. این پروژه در مرکز تولید میگوی عاری از بیماری خلیج فارس اجرا شد.

فاکتورهای فیزیکی و شیمیایی آب نظیر دما، pH، اکسیژن محلول به صورت روزانه (صبح و عصر) اندازه‌گیری و فاکتورهای تعداد کل باکتریها (total count)، تعیین تعداد ویبریوها (Vibrio count)، آمونیاک محلول درآب، نیتریت، آمونیوم، نیترات و شوری نیز به صورت هفتگی اندازه‌گیری و در فرم های خاص ثبت شده و نسبت به تغییرات آنها بررسی های لازم صورت گرفت.

برای تعیین تعداد کل باکتریها و تعیین تعداد ویبریوها به روش زیر اقدام شد. از نمونه های آب جدا شده از مکان‌های تعیین شده در طول مسیر انتقال آب از دریا به تانک ها و استخرها، رقت تهیه شد و از هرکدام از رقت‌های تهیه شده (استاندارد ملی ایران 4207)، 1/0 میلی لیتر از آزمونه را با رعایت شرایط استریل روی پلیت حاوی محیط کشت Tryptic Soy Agar تهیه شده با آب دریا (TSA نمکی) ریخته و روی سطح محیط پخش گردید. پس از جذب نمونه تلقیحی پلیت‌ها در انکوباتور با دمای 30 درجه سلسیوس به مدت 72 ساعت انکوبه شدند و تعداد کلنی‌ها در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت شمارش و ثبت گردید. نتایج محاسبه شده تا دو رقم معنی‌دار گرد شده و به صورت تعداد N باکتری درهر میلی لیتر آب گزارش شدند.

شمارش کلی باکتری های خانواده ویبریوناسه در نمونه های آب استخرهای پرورش میگو مطابق با روش شمارش کلی باکتری های هتروتروف هوازی و بی هوازی اختیاری انجام گردید (استاندارد ملی ایران 1-8923 و استاندارد ملی ایران 9899) ولی از محیط کشت تیوسولفات - سیترات - نمک صفراوی - ساکارز آگار (TCBS) استفاده شد. ضروری است به صورت دوره‌ای نسبت به نمونه‌گیری از آب تانک‌های پرورشی جهت انجام آزمونهای میکروبیولوژی (باکتری و قارچ) اقدام شد.

برای افزایش احتمال جداسازی قارچ ها از نمونه های آب از محیط های مختلف استفاده می شود. محیط‌های مورد نظر شامل مالت اکسترکت آگار، سیب زمینی دکستروز آگار و روزبنگال آگار می باشد و برای جلوگیری از رشد کردن باکتریها بر روی محیط‌های قارچی و ایجاد اختلال در فرآیند جداسازی و شناسایی آنها از افزودن کلرامفنیکل به تمامی محیط های بهره برده شد. با توجه به حساسیب برخی از ساپروفیت ها به این آنتی‌بیوتیک ضدباکتریایی، همزمان از محیط های فاقد آنتی بیوتیک نیز استفاده گردید..

برای شناسایی قارچ‌های جدا شده از نمونه‌ها، براساس روش‌های رایج در آزمایشگاه و با توجه به کلید‌های تخصصی موجود برای شناسایی قارچ های رشته‌ای (بر اساس اختلاف‌های مرفولوژیک آنها روی محیط کشت) و اقدام گردید.

محیط Czapek Yeast extract Agar CYA)) با فرمولاسیون ارائه شده توسط pitt وHoking (2009) تهیه و مورد استفاده قرار خواهد گرفت.

K2HPO4

1 گرم

محیط کشت Czapek

10 ملیی لیتر

پودر عصاره مخمر

5 گرم

Sucrose

30 گرم

Agar

15 گرم

distilled Water

1 لیتر

برای بررسی دقیق ساختار زایای قارچ ها از روش کشت روی لام استفاده می شود. برای این منظور در یک پلیت خالی استریل مقداری از محیط سابرودکستروز و صبر می‌کنیم تا منعقد شود. بعد با استفاده از اسکالپل استریل مقداری از محیط به ابعاد یک سانتیمتر مربع بریده و در شرایط استریل آنرا روی لام قرار می‌دهیم (می توان لام را چند بار از روی شعله عبور داده تا استریل شود). بعد از اینکه آگار کاملا در مرکز لام قرار گرفت آنرا روی لوله "یو" شکل که درون یک پلیت شیشه‌ای بزرگ است بصورت افقی قرار می‌دهیم. بعد با استفاده از آنس استریل، سوش قارچی مورد نظر را در 4 نقطه از محیط روی لام تلقیح کنید. یک لامل برداشته و پس از استریل کردن بر روی شعله و خنک کردن در مجاورت شعله آن را روی قطعه آگار تلقیح شده قرار می دهیم. بعضی از ریسه ها بعد از رشد از آگار خارج شده و به قسمت زیرین لامل می چسبد بطوریکه به آسانی زیر میکروسکوپ دیده می شوند. برای جلوگیری از خشک شدن قطعات آگار در طول مدت انکوباسیون حدود 10 میلی لیتر آب مقطر استریل را در داخل پلیت می ریزیم و دقت می کنیم تا آب روی قطعه آگار یا لام و لامل نریزد و درب پلیت را می بندیم. پلیت را بمدت یک هفته در دمای اتاق انکوبه می‌کنیم. در صورت تبخیر آب درون پلیت می توانید مجدداً به آن آب اضافه کنیم. بعد از انکوباسیون می‌توان لامل را جدا کرده و در زیر میکروسکوپ آنها را بررسی می‌نماییم.

پایش بیماریهای باکتریایی و قارچی در مرحله پست لاروی قبل از ذخیره سازی انجام شد و این مراحل پایشی در F2 و F3 نیز تکرار گردید. در هر مرحله از پایش که آزمون باکتری شناسی یا قارچ شناسی مثبت می‌شد، در صورت امکان درمان انجام می‌گردید.

تعیین جمعیت های اولیه برای تولید میگوی مولد عاری از بیماری خاص

با توجه به اینکه مراکز تکثیر، در طی سال 1390 و 1391، مولدین خود را از مولدین پرورشی مراکز پرورش به ویژه در استان‌های بوشهر و هرمزگان تهیه نموده بودند، نسبت به ترسیم تاریخچه مولدین مراکز تکثیر اقدام و مراکز پرورش میگو جهت تهیه و جمع‌آوری مولد انتخاب شد. از این رو در تاریخ 05/06/91 لیست مراکز پرورش میگو همراه با تاریخ تقریبی زمان برداشت برای مولد سازی میگوی عاری از بیماری خاص ارائه گردید. بر اساس مراکز انتخاب شده و به منظور پایش، جداسازی و شناسایی عوامل بیماریزای باکتریایی و قارچی در تاریخ‌های 25 و 26/06/91 از دو مزرعه در سایت پرورش میگوی حله و در تاریخ‌های 8 و 09/07/91 از مزارع انتخاب شده در سایت‌های پرورش حله، رودشور و دلوار 14، دلوار 2 و بندر ریگ، هرکدام 60 قطعه بطور تصادفی نمونه‌گیری صورت گرفت و به آزمایشگاه میکروبشناسی منتقل گردید.

نمونه گیری به صورت هفتگی، از آب محل تکثیر یا پرورش در ظروف نمونه‌برداری استریل صورت گرفت (برای هر نمونه سه تکرار در نظر گرفته شد).

آغاز نمونه‌گیری از آبان 1391، نمونه برداری از:

¾ از آب دریا در محیط پیرامون ایستگاه پمپاژ، استخر رسوب‌گیر، استخر کلرزنی و تانک های سالن قرنطینه

¾ در بهمن و اسفند 91 و فروردین 92 نمونه برداری از:

¾ آب دریا (استخرهای رسوب گیر و کلرزنی)

¾ تانک‌های سالن قرنطینه

¾ استخرهای گلخانه

در اردیبهشت و تیر 92 نمونه برداری از:

¾ آب دریا (استخرهای رسوب‌گیر و کلرزنی)

¾ بعد از فیلتراسیون

¾ تانک های مولدین نر

¾ تانک های مولدین ماده

¾ در مرداد تا مهر ماه سال 92 نمونه‌گیری از:

¾ آب دریا (استخرهای رسوب‌گیر و کلرزنی)

¾ بعد از فیلتراسیون

¾ تانک‌های نگهداری مولدین

از آبان ماه سال 92 تا اردیبهشت ماه سال 93 نمونه‌گیری از:

¾ آب دریا (استخرهای رسوب‌گیر و کلرزنی)

¾ بعد از فیلتراسیون

¾ تانک‌های سالن قرنطینه

¾ استخرهای گلخانه

از خرداد تا مرداد ماه سال 93 نمونه‌گیری از:

¾ آب دریا (استخرهای رسوب‌گیر و کلرزنی)

¾ بعد از فیلتراسیون

¾ تانک‌های سالن قرنطینه

در صورتی که نمونه نیاز به رقیق شدن داشته باشد در کنار شعله و توسط پی پت استریل، 1 میلی‌لیتر از نمونه را به 9 میلی لیتر محلول نمکی 5/2 درصد استریل اضافه و به آرامی مخلوط گردید ( رقت 1/0).

از لوله اول ( رقت 1/0) 1 میلی لیتر به 9 میلی لیتر محلول نمکی 5/2 درصد استریل اضافه شد و به آرامی مخلوط گردید ( رقت 01/0) و این مراحل را تا تهیه رقت مورد نظر، به گونه ای که تعداد مورد انتظار کلنی‌های تشکیل شده بین10 تا 150 کلنی تیپیک باشد و تعداد کل کلنی های تیپیک و غیرتیپیک روی پلیت باید کمتر از 200 باشد ادامه داده شد.

روش کشت:

برای هر رقت حداقل دو پلیت محیط کشت در نظر گرفته شد، تمام نمونه ها و رقت های تهیه شده توسط شیکر مکانیکی به مدت 15 ثانیه خوب مخلوط گردید و سپس 1/0 میلی لیتر از آزمونه روی پلیت ریخته شد و با میله شیشه ای ال شکل که قبلاً توسط الکل 70درصد و شعله استریل شده است روی سطح محیط پخش گردید. پس از جذب نمونه تلقیحی، پلیت ها را به صورت وارونه در انکوباتور با دمای 30 درجه سلسیوس به مدت 72 ساعت انکوبه شدند. تعداد کلنی ها روی پلیت ها در زمان های 24، 48 و 72 ساعت شمارش وثبت گردید.

در کلیه مراحل اجرای پروژه، بر اساس نیاز از میگوهای مشکوک، تجهیزات ضدعفونی آب و غیره نمونه‌گیری و مطابق با اصول میکروب‌شناسی آزمون های ضروری صورت گرفت.

نتایج:

در گزارش نهایی نتایج مربوط به این تحقیق در 21 جدول در بخش نتایج ارائه شده است.

در خصوص مطالعات مورد ی می توان بیان کرد که در بررسی نمونه های کلرزده شده (نیمه دوم شهریور 1391) با توجه به پایین بودن تعداد کل باکتری‌های خانواده ویبریوناسه و بالاتر بودن بار باکتریایی کل، می توان اعلام نمود که میزان کلر استفاده شده از کفایت لازم برخوردار نبوده و توصیه شد از دوز تعریف شده در دستورالعمل‌های بهداشتی استفاده شود.

بررسی نمونه‌های دستگاه اولترافیلتراسیون در تیرماه سال 92 نشان داد که اثر مطلوبی بر باکتری‌های خانواده ویبریوناسه داشته ولی فراوانی باکتری‌های ویبریوناسه را به صفر نمی‌رساند. در شمارش کلی باکتری‌ها مشخص شد که اولترافیلتراسیون آب ورودی، فراوانی باکتری‌ها را تا 3 برابر افزایش می‌دهد. در این مرحله باکتری‌های موجود در آب دریا وارد محیط شده و موجب تشکیل شدن کلنی‌های باکتریایی در فیلترهای دستگاه می‌شدند. پیشنهاد گردید، دستگاه با مواد ضدعفونی کننده‌ی دیگری بجز کلر (مواد ضدعفونی کننده رنگی مانند آیوداین به دلیل تغییر رنگ فیلترهای دستگاه توصیه نشد) ضدعفونی شود.

در بررسی دستگاه UV مشخص شد که یک لامپ از مجموع 4 لامپ دستگاه فاقد عملکرد بوده و به منظور تعیین میزان عملکرد دستگاه، به دو صورت نمونه‌برداری صورت گرفت؛ حالت اول، وقتی که هر چهار کانال باز باشد و حالت دوم، زمانی که کانال دارای لامپ معیوب از سیستم عبور آب خارج گردد. در حالت چهار کاناله، میزان باکتری های خانواده ویبریوناسه صفر شد اما میزان کلی باکتریهای هوازی به یک یازدهم تقلیل یافت اما صفر نشد. در حالت سه کاناله، در این حالت میزان باکتری های خانواده ویبریوناسه صفر شد و میزان کلی باکتری‌ها بسیار کم شد اما باز هم صفر نشد.

نتایج دستگاه UV نشان داد که یکی از دلایل عدم کارایی مورد انتظار دستگاه، از کار افتادن یکی از لامپ‌های UV بود. همچنین با توجه به زنگ زدگی جداره داخلی دستگاه، شیشه کوارتز دستگاه که بین لامپ و آب قرار دارد و با کوچکترین آلودگی بر روی این شیشه قدرت تابشی لامپ‌ها کاهش می‌یابد. از این رو اقدامات لازم برای جایگزین کردن لوله و اتصالات PVC با استیل بکار رفته در دستگاه انجام شد.

در تاریخ 6 فروردین 1393 ، مرگ و میر میگو از استخر گلخانه گزارش گردید که پس از اعزام کارشناسان و نمونه برداری فراوانی باکتریایی در آب و کف استخر نسبت به اسفند ماه بالاتر بود و نمونه‌برداری جهت احتمال وجود عامل بیماریزای باکتریایی و قارچی نیز صورت گرفت. بر اساس نتایج آزمون های صورت گرفته کلیه عوامل احتمالی میکروبی منفی بود و علت مرگ و میر با توجه به بالا بودن فراوانی باکتریایی در آب و کف استخر و همچنین تجمع جلبکی در کف، کمبود اکسیژن و شکست شکوفایی پلانکتونی اعلام شد که با تعویض آب و انتقال میگوها به استخر مجاور مشکل برطرف گردید.

دستور العمل فنی و توصیه ترویجی:

تولید و یا استفاده از میگوهای مولد عاری از بیماری خاص، سبب کاهش ریسک بروز بیماریها در مراکز تکثیر و پرورش میگو می گردد و استقرار ایمینی زیستی و رعایت اصول مربوطه در کلیه مراکز تکثیر و مزارع پرورشی توصیه می گردد.

ویژگی مناطق کاربرد توصیه ترویجی:

کلیه مراکز تکثیر و پرورش میگو

گزارش پروژه
مشخصات پیمانکار
مشخصات همکاران
اهداف طرح
زمانبندی طرح
روش تحقیق و اجرا
اطلاعات جغرافیایی
هزینه های اجرای پروژه
نتایج