اهمیت، ضرورت، اهداف و روش تحقیق :
با توجه به توسعه سریع میگوی سفید غربی در سرتاسر کشور شواهد دال بر این می‌باشد که علیرغم گذشت کمتر از یک دهه از معرفی این گونه به عنوان گونه جایگزین در کشور، بسیاری از صفات منحصر به فرد آن از جمله سریع الرشد بودن، تراکم پذیری بالا، بازماندگی بالا در مرحله لاروی و مقاوم بودن در مقابل عوامل بیماریزا از لحاظ کمیتی با نزول روبرو شد بود. افزایش تقاضا برای پرورش لاروهای تولید شده در مراکز تکثیر میگوی در شرایط کنترل شده منجر به این شده که برای دستیابی به نسل‌هایی با معیارهایی از قبیل تولید بهتر و مقاومت در برابر بیماری، انتخاب مولدین در این مراکز بر اساس صفات فنوتیپی صورت می‌گیرد که این نوع انتخاب در اکثر موارد منجر به افزایش جفت گیری میان موجودات خویشاوند شده است و معمولاً با کاهش میزان بازماندگی، رشد و تولید مثل در زاده‌ها تولید شده همراه بوده است. از این رو نظارت بر روی ساختار ژنتیک مراکز تکثیر از اهمیت ویژه‌ای برخوردار می‌باشد.
بنابراین شاید بتوان اینگونه ادعا کرد که در طی سالهای گذشته مهمترین علت از بین رفتن برخی از صفات بارز این گونه به علت عدم شناسایی جمعیت‌های مختلف میگوهای پرورشی و تعیین شاخص‌های ژنتیکی در نسلهای مختلف آن باشد. از این رو اجرای برنامه های اصلاح نژادی و مدیریت منابع شیلاتی نیازمند داشتن اطلاعات دقیق از ساختار ژنتیکی جمعیت‌های میگو و تنوع ژنتیکی مرتبط با آن است. استفاده از تکنیک‌های پیشرفتة مولکولی امروزه توانسته تفاوت بین افراد را در سطح مولکول DNA مشخص نمایند. از جمله این روش‌ها استفاده از نشانگرها هسته‌ای و میتوکندریایی همانند نشانگرهای ریزماهواره‌ای، D-LOOP و 16S rRNA می‌باشد که به عنوان ابزارهای ژنتیکی کارآمدی برای تعیین هویت حیوانات اهلی و غیراهلی همچنین مشخص نمودن والدین و روابط ژنتیکی بین آنها بکار برده می‌شوند. امروزه استفاده از این نشانگرها به عنوان یک ابزار مفید جهت تعیین روابط فیلوژنتیک میان موجودات، تعیین پیوستگی جمعیت‌ها و تکامل موجودات و آنالیز فیلوژنتیکی بمنظور تعیین شاخص‌های ژنتیکی، شناسایی روابط خویشاوندی و تفاوت‌های ژنتیکی میان افراد یک گونه مطرح است. در این مطالعه سعی شد که هم بهگزینی میگوها بر اساس شاخص‌های ژنتیکی صورت گیرد و هم اینکه با تعیین تفاوت‌ها و شباهت‌های ژنتیکی میان نسلهای مختلف میگو از آمیزش‌های ناخواسته میان افراد یک جمعیت جلوگیری به عمل آید تا از این طریق از افزایش ضریب هم خونی و کاهش شاخص‌های ژنتیکی در بچه میگوهای تولید شد ممانعت شود.
از مهمترین اهداف این پروژه
- تعیین تفاوت های ژنتیکی در میگوهای سفید غربی عاری از عوامل بیماریزا در نسل های مختلف
- تعیین شاخص های ژنتیکی و فنوتیپی مؤثر در انتخاب مولد های اصلح در هر نسل
- تعیین رابطه خویشاوندی میان مولدین و نتاج حاصل از هر نسل
بمنظور تهیه شاخص‌های ژنتیکی و تعیین میزان تنوع ژنتیکی در میگوهای پرورشی نسلهای مختلف از بافت عضلانی نمونه‌گیری به عمل آمد (شکل 1). در ادامه پس از استخراج ماده ژنتیکی (DNA) هر یک از نمونه‌ها با استفاده از 12 جفت نشانگر اختصاصی هسته‌ای از طریق روش مولکولی ریزماهواره‌ای و تکثیر در دستگاه ترموسایکلر شاخص‌های ژنتیکی آنها بررسی شد (شکل 2).
شکل 1: نمونه گیری از بافت عضله میگوهای پرورشی مراکز پرورش و نگهداری در الکل 96 درجه
شکل 2: تزریق محصول PCR بر روی ژل آکریل آمید دستگاه الکتروفورز عمودی کلور و باندهای تشکیل شده بر روی ژل آکریل آمید
با توجه به جمعیت‌های شناسایی شده برنامه آمیزش‌های درون گروهی و بین گروهی میان مولدین برنامه ربزی شد تا از این طریق میگوهای نسل دوم تولید شود (نمودار 1) (شکل 3).
ò
نمودار 1: برنامه تلاقی درون گروهی و بین گروهی مولدین نسل صفر
شکل 3: بهگزینی پیش مولدین میگوی نسل صفر
تعیین تفاوت‌های ژنتیکی و رابطه خویشاوندی میان نسلهای مختلف میگو
با توجه به وجود دو جمعیت مولوکائی و های‌هلث به عنوان مولدین نسل صفر میگوی سفید غربی، پس از آمیزش درون گروهی و بین گروهی میان مولدین نر و ماده دو جمعیت فوق، سه ذخیره مختلف H♂×M♀، M♂×H♀ و H♀×H♂ به عنوان میگوهای نسل اول تولید شدند و در نهایت میگوهای نسل دوم از آمیزش مولدین ذخیره H♂×M♀ نسل اول بوجود آمدند. بمنظور بررسی رابطه خویشاوندی و تفاوت‌های ژنتیکی میان نسلهای مختلف میگوی سفید غربی عاری از بیماری خاص در این مطالعه از نشانگرهای منطقه کنترلی d-loop و 16S rRNAمیتوکندریایی به ترتیب با طول bp 1451 و 529 استفاده شد. لذا بعد از استخراج DNA میتوکندریایی نسلهای مختلف میگو و تکثیر قطعه هدف، توالی یابی آن بر اساس Sanger و همکاران (1977) با استفاده از توالی یاب اتوماتیک ABI 377 (Applied Biosystems Inc.) توسط شرکت Seq/Teq/California/USA انجام شد. مقایسه اولیه توالیهای حاصل از این نشانگرهای فوق با استفاده از نرم افزار آنلاین ClustalW2 انجام شد. در ادامه با استفاده از نرم افزار Nuoclotid Blast مقایسه توالیهای بدست آمده با توالیهای مشابه در سایت NCBI صورت پذیرفت. همردیفی چندگانه کلاستال (ClustalW Multiple Aligment) با استفاده از نرم افزار BioEdite با هدف محاسبه ترکیب بازی توالی‌ها و نسبت جانشینی ترانزیشن به ترانسورژن انجام شد. همچنین بمنظور دستیابی به ماتریکس فاصله ژنتیکی براساس روش Kimura-2-parameter و شرایطی از قبیل حذف کامل Gap یا حذف باز‌های جفت جفت (Pairwise) با در نظر گرفتن جهش‌های ترانزیشن و ترانسورژن، سرعت یکنواخت و الگوی هموژن بین افراد با استفاده از نرم افزار MEGA 7.0 محاسبه شد.
نتایج :
براساس نتایج بدست آمده مشاهده شد که از میان جمعیت‌های مختلف وارد شده به کشور تنها دو جمعیت مولوکائی و های‌هلث به عنوان مولدین نسل اول شناسایی شدند (جدول 1 و نمودار 1).
جدول 1: مقادیر فاصله موجود در میان جفت جمعیت‌های مورد مطالعه
|
جمعیت
|
فاصله ژنتیکی
|
|
ترکیبی
|
های هلث
|
|
های هلث
|
512/0
|
|
|
مولوکائی
|
357/0
|
615/0
|
-
نمودار 1: درخت موضع شناسی تکاملی براساس فاصله ژنتیکی (براساس معیار Nei, 1972)
لذا به دلیل شباهت ژنتیکی میگوهای دو جمعیت مولوکائی و ترکیبی و همچنین بمنظور افزایش میزان تنوع ژنتیکی میگوهای این دو جمعیت به عنوان یک جمعیت در نظر گرفته شدند، که پس از آمیزش درون گروهی و بین گروهی صورت گرفته میان مولدین نر و ماده دو جمعیت مولوکائی و های‌هلث در نهایت سه ذخیره مختلف تولید شدند.
نتایج مطالعات مولکولی حاکی از آن بود که از میان ذخیره‌های نسل دوم تولید شده شاخص‌های ژنتیکی میگوهای ذخیره مولوکائی (ماده)×های‌هلث (نر) از قبیل فراوانی آلل‌های مؤثر، هتروزیگوسیتی مشاهده شده و تنوع ژنتیکی آنها بطور معنی داری بیشتر از سایر ذخیره‌ها بود. این در حالی بود که شاخص‌های ژنتیکی ذخیره‌های حاصل از آمیزش‌های درون گروهی (III و VI) بطور معنی داری کاهش یافته بود. از سوی دیگر به دلیل آمیزش درون گروهی صورت گرفته میان آنها میزان ضریب هم خونی نیز به شدت افزایش یافته بود (جدول 2).
جدول 2:میزان تنوع ژنتیکی میگوهای نسل دوم
|
(Ho - He)
|
ذخیره
|
P value
|
|
هتروزیگوسیتی مشاهده شد در مقابل هتروزیگوسیتی مورد انتظار
|
مولوکائی × های‌هلث (M.H)،
|
107/0
|
|
های‌هلث × مولوکائی (H.M)
|
028/0
|
|
های‌هلث × های‌هلث (H.H)
|
036/0
|
نتایج حاصل از تمایز ژنتیکی میان ذخیره‌های مورد مطالعه حاکی از وجود یک تمایز ژنتیکی پائین تا متوسط بود. به گونه ای که تمایز ژنتیکی موجود میان ذخیره‌های مولوکائی × های‌هلث (M.H) با های‌هلث × مولوکائی (H.M) 078/0 بود که در سطح پائنی قرار داشت و از لحاظ آماری کاملاً معنی دار بود (P<0.001) (جدول 3).
جدول 3: مقادیر تمایز ژنتیکی ذخیره‌های مختلف نسل دوم
|
ذخیره
|
H.H
|
H.M
|
|
M.H
|
103/0
|
078/0
|
|
H.M
|
036/0
|
000/0
|
همچنین بیشترین میزان فاصله ژنیتکی میان ذخیره مولوکائی × های‌هلث با ذخیره های‌هلث × های‌هلث و کمترین میزان میان ذخیره های‌هلث × مولوکائی با های‌هلث × های‌هلث وجود داشت (جدول 4) (نمودار 2).
جدول 4: مقادیر فاصله موجود در میان جفت جمعیت‌های مورد مطالعه
|
ذخیره
|
فاصله ژنتیکی
|
|
H.H
|
H.M
|
|
M.H
|
369/0
|
299/0
|
|
H.M
|
142/0
|
00/0
|
-
نمودار 2: درخت موضع شناسی تکاملی براساس فاصله ژنتیکی (براساس معیار Nei, 1972)
نتایج :
. نتایج بررسی منطقه d-loop نشان داد که از 997 جایگاه شناسایی شده در هر یک از نسلهای مختلف میگو تعداد 6 هاپلوتیپ‌ها و 799-766 جایگاه‌های مونومورف تعیین شد. با وجود اینکه میزان تنوع هاپلوتیپی و تنوع نوکلئوتیدی برای کل نسلهای مختلف میگوی عاری از بیماری خاص به ترتیب 877/0 و 12/0 درصد بود. لیکن نتایج نشان داد که میزان هموزیگوسیتی از نسلی به نسل دیگر در حال افزایش است و فاصله ژنتیکی اندکی میان نسلهای مختلف میگوی عاری از بیماری خاص مشاهده شد. لذا با توجه به نتایج بدست آمده اینگونه می‌توان عنوان نمود که عدم ورود مولد جدید از خارج از کشور و آمیزش‌های صورت گرفته میان مولدین نر و ماده خویشاوند به دلیل کوچک شدن جمعیت مؤثر و رانش ژنتیکی ایجاد شده تعداد هاپلوتیپ‌ها از نسل صفر به نسل دوم به تدریج کاهش یافته است. از این رو به دلیل رابطه خویشاوندی بالای میان نسلهای مختلف میگو در بررسی منظقه d-loop ژنوم میتوکندری اختلاف ژنتیکی کمی میان آنها مشاهده شد.
آنالیز فیلوژنتیک هاپلوتیپ‌های منطقه d-loop میتوکندریال نسلهای مختلف میگوی سفید غربی عاری از بیماری خاص براساس الگوریتم Neighbor-Joining
این در حالی بود که بررسی منطقه 16S rRNA نشان داد که از 486 جایگاه شناسایی شده 484 جایگاه بصورت محافظت شده وجود دارد. همچنین تعداد جایگاه مونومورف در دامنه 486-482 قرار داشت که شامل 2 جایگاه پلی‌مورف و 2 جایگاه انتقالی بود. این در حالی بود که تنها 2 هاپلوتیپ شناسایی شد که میزان تنوع هاپلوتیپی و تنوع نوکلئوتیدی محاسبه شده به ترتیب 159/0±356/0 و 00147/0 بود، که حاکی از پائین بودن میزان تنوع هاپلوتیپی و نوکلئوتیدی در نسلهای مختلف میگوی سفید غربی می‌باشد. همچنین با توجه به شباهت بالای ژنتیکی نسلهای مختلف میگو و کاهش فاصله ژنتیکی میان آنها میزان تمایز ژنتیکی و جریان ژنی بین نسلهای مختلف میگو به ترتیب 142/0- و 00/2- اندازه‌گیری ش، که این حالت ممکن است به دلیل کوچک شدن جمعیت مؤثر و رانش ژنتیکی اتفاق افتاده باشد. لذا با توجه به اینکه ژنوم میتوکندری از مادر به فرزندان به ارث می‌رسد، انتظار می رود که میزان تنوع در این ژنوم تحت تأثیر عوامل متعددی از جمله رانش ژنتیکی به دلیل عدم دسترسی به مولدین جدید قرار گرفته باشد. از این رو مشاهده شد که به دلیل حفاظت بالای ژنوم میتوکندری در منطقه 16S rRNA هیچگونه تمایز ژنتیکی میان نسلهای مختلف میگوی عاری از بیماری خاص مشاهده نشد.
آنالیز فیلوژنتیک منطقه 16S rRNA میتوکندریال نسلهای مختلف میگوی سفید غربی عاری از بیماری خاص براساس الگوریتم Neighbor-Joining
دستور العمل فنی و توصیه ترویجی :
با توجه به نتایح بدست آمده از این طرح اینگونه می‌توان عنوان نمود که ژنوم 16SrRNA میتوکندریایی در مقایسه با سایر نشانگرهای میتوکندریایی از قبیل منطقه COI و d-loop به دلیل وجود مناطق حافظت شده در این منطقه از ژنوم و کوچک بودن طول این ناحیه از سرعت تکاملی پائین تری برخوردار می‌باشد. بنابراین بررسی ژنوم این منطقه هیچگونه تفاوت ژنتیکی میان نسلهای مختلف یک گونه را نشان نمی‌دهد. از این رو تنها کاربرد این نشانگر تعیین روابط فیلوژنتیک میان گونه‌های مختلف میگوهای خانواده پنائیده با همدیگر یا با سایر موجودات می‌باشد.
از سوی دیگر استفاده از قطعه d-loop ژنوم میتوکندریایی میگوهای سفید غربی، قادر به نشان دادن روابط خویشاوندی میان نسلهای مختلف میگو نمی‌باشد، لیکن با توجه به اینکه این منطقه در میتوکندری میگوها فاقد هر گونه ژن رمز کننده‌ای می‌باشد، بنابراین وقوع هر گونه جهش می‌تواند در آنجا تثبیت گردد. لذا توصیه می‌گردد که به دلیل وجود مناطق محافظت شده کمتر در سایر مناطق ژنوم میتوکندریایی همانند منظقه COI و d-loop از این مناطق جهت تعیین تفاوت‌های ژنتیکی میان نسلهای مختلف میگو بصورت درون گونه‌ای استفاده گردد و یا اینکه از روش میکروستلایت جهت تعیین تفاوت‌های ژنتیکی، تنوع ژنتیکی و هتروزیگوسیتی در نسلهای مختلف استفاده گردد. همچنین پیشنهاد می‌گردد محققان گرامی در مطالعات آینده جهت تعیین روابط خویشاوندی میان نسلهای مختلف میگو بجای استفاده از نشانگرهای میتوکندریایی از روش نوین چندریختی تک نوکلئوتیدی استفاده نمایند.
ویژگی مناطق کاربرد توصیه ترویجی :
می‌توان با تدوین یک دستورالعمل فنی و ارائه آن به ادارات کل شیلات و دامپزشکی استان‌ها اقدامات کاربردی را در کلیه مراکز تکثیر و پرورش میگوی کشور که قصد مولد سازی و تکثیر میگو را از طریق پیش مولدین پرورشی در داخل کشور دارند به مرحله اجرا در آورد. تا از این طریق با شناسایی جمعیت‌های مختلف میگو در هر یک از مراکز تکثیر و شناسنامه دار کردن آنها از آمیزش‌های خویشاوندی میان افراد یک خانواده و جمعیت جلوگیری به عمل آید.