دوشنبه 18 اردیبهشت 1396

عنوان طرح /پروژه : بررسی اثر اخلال گر هورمونی نونیل فنل بر تولید ویتلوژنین پلاسما و تغییرات سطوح IgM و لیزوزیم در ماهی کپور کوی

شماره مصوب : 91002-8919-12-12-014 واحد اجرا : مؤسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور محل اجرا: موسسه تخقیقات علوم شیلاتی کشور نام هماهنگ‌کننده /مجری مسئول /مجری : همایون حسین زاده صحافی سل شروع : 1394 سال خاتمه: 1395
وضعیت اجرا شده | پروژه های خاتمه یافته | بازدید: 1021 مرتبه | 0 نظر

اهمیت ، ضرورت ، اهداف و روش تحقیق :

پژوهش حاضر به بررسی تأثیر اختلالات آندوکرینی نونیل فنل اتوکسیلات بر تولید ویتلوژنین پلاسما و تغییرات سطوح IgM و لیزوزیم در ماهی کپور کوی (Cyprinus carpio carpio) پرداخته است. بدین منظور ماهیان با میانگین وزنی گرم در غالب 6 تیمار (با دارابودن یک گروه کنترل الکلی- کنترل مثبت و یک گروه دریافت کننده 17 بتااسترادیول به عنوان گروه زنواستروژنیک به همراه 3 تکرار، در مدت 21 روز و به صورت تزریق درون صفاقی غلظت های 10، 50 و 100 میکروگرم بر گرم وزن بدن، نونیل فنل دریافت نمودند. گروه کنترل الکلی تنها محلول روغن نارگیل و اتانول دریافت نمودند، درحالیکه برای ماهیان گروه کنترل هیچ گونه تزریقی صورت نپذیرفت. در روز 22، ماهی ها به تعداد 10 قطعه در هر تیمار بیهوش و بیومتری ماهیان (اندازه گیری طول با استفاه از خط کش و وزن ماهی ها با استفاده از ترازوی دیجیتال با دقت 1/0 گرم انجام شد. پس از بیومتری، از ساقه دمی ماهی با استفاده از سرنگ هپارینه از هر ماهی 1 سی سسی خونگیری شد و در میکروتیوب های هپارینه جمع آوری شد.میکروتیوب های حاوی خون ماهی به مدت 4-3 ساعت در یخچال ( ) قرار داده شدند و سپس به آزمایشگاه منتقل و به مدت 10 دقیقه در rpm 1500 سانتریفیوژ شدند. پلاسمای حاصل، جداشده و تا زمان سنجش شاخص های ایمنی (IgM، لایزوزیم) و ویتلوژنین کل پلاسما در فریزر نگه داری شدند. به منظور اندازه گیری میزان ایمونوگلوبین IgM (M) از روش پیشنهاد شده Siwickiو Anderson در سال 1993استفاده گردید. روش اندازه گیری به این صورت است که IgM با آنتی بادی های پلی کلونال موجود درمحلول تشکیل کمپلکس داده و باعث کدر شدن محلول می شود.میزان کدورت ایجاد شده با مقدار IgMرابطه مستقیم دارد. در این تحقیق IgM با استفاده از کیت شرکت Bioscience و دستگاه اتوآنالایزر مدل Eurolyser ساخت کشور اتریش اندازه‌گیری شد Siwicki,1993) . ( Anderson and

به منظور اندازه گیری سطوح لیزوزیم از روش توصیه شده Ellis در سال 1990 استفاده گردید. اندازه گیری فعالیت آنزیم لیزوزیم به عنوان یکی از شاخص های ایمنی ذاتی با استفاده از سرم خون و روش جذب نوری به همراه سنجش کدورت صورت پذیرفت بدین منظور، در ابتدا 15 میکرولیتر همولنف با 135 میکرولیتر از سوسپانسیون 2/0 میلی‌گرم درمیلی‌لیتر باکتری میکروکوکوس لیزوداکتیکوس (سیگما) در بافر 02/0 مولار سدیم سیترات (8/5 =pH) در گوده‌های میکروپلیت تخت 96 خانه¬ای الایزا مخلوط ¬گردید و جذب نوری آن در دمای اتاق در زمان‌های صفر و 6 دقیقه بعد از مخلوط‌سازی در طول موج 450 نانومتر اندازه‌گیری شد. میزان فعالیت لیزوزیم سرم با توجه به منحنی استاندارد مربوط به لیزوزیم سفیده تخم¬مرغ سیگما تعیین گردید (Ellis ,1990). میزان ویتلوژنین در پلاسما توسط روش الایزا مورد آزمون قرار گرفت (Zhang et al., 2011). ابتدا حفره های پلیت 96 خانه ای توسط آنتی بادی اولیه (استخراج شده از خرگوش با رقت 5000: 1) یک شب گذرانی (12 ساعت) در 4 درجه سانتی گراد، پوشانده شدند . بعد از شستشو با محلول توئین 20، 1/0 درصد حاوی بافر نمکی فسفات، بافر بلوکه کننده شامل 200 میکرولیتر بافر نمکی فسفات حاوی 5/0 درصد BSA، اضافه شد. از کلیه نمونه های مورد تیمار قرار گرفته (نمونه پلاسما) یا آنتی ژن، 50 میکرولیتر در حفره ها بارگذاری شد تا به مدت 1 ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند. بعد از 3 بار شتشو با بافر نمکی فسفات، واکنش با آنتی بادی ثانویه Peroxidase Conjugated AntiRabbit IgG به مدت 1 ساعت (در دمای اتاق) انجام شد. شستشو با بافر فسفات نمکی 3 بار تکرار شد و در انتها از 100 ماکرولیتر از مخلوط واکنش رنگی (تترا متیل بنزدین) روی خانه ها استفاده شد. این واکنش به مدت 1 ساعت در دمای اتاق ادامه یافت و با اضافه کردن 100 ماکرو لیتر اسید سولفوریک 1 نرمال متوقف شد. جذب واکنش در طول موج 492 نانومتر توسط دستگاه خوانش الایزا تعیین شد.

نتایج :

. اثر استروژنیک 4- نونیل فنل به وسیله تحریک سنتز پیش ماده پروتئین های زرده ویتلوژنین در جنس نر و ماده نابالغ ماهی کپور کوی مشخص شد.سطح ویتلوژنین پلاسما درجنس ماده در یک رفتار وابسته به دوز پس از تزریق شروع به افزایش کرد ،به طوری که در غلظت های 10 و 50 میکروگرم بر گرم افزایش معنی داری دیده شد(05/0P<).اما بیشترین افزایش مربوط به غلظت 50 میکروگرم برگرم (1± 58) بود (05/0P<). میزان پروتئین لایزوزیم در غلظت های 10 و 50 میکروگرم در گرم نونیل فنل در جنس ماده افزایش معنی داری در مقایسه با گروه کنترل داشت، ولی در تیمار 100 میکروگرم در گرم نونیل فنل کاهش معنی داری پیدا کرد (05/0p<). میزان لیزوزیم در تیمار 17-بتااسترادیول (2 میکروگرم در گرم) اختلاف معنی داری نسبت به تیمارهای نونیل فنل و گروه کنترل داشت. میزان ایمونوگلوبولین ام در غلظت های پایین و متوسط نونیل فنل 10 و 50 میکروگرم در گرم در جنس ماده به طور معنی داری نسبت به گروه کنترل افزایش پیدا کرد، ولی در غلظت بالای نونیل فنل( 100 میکروگرم در گرم )به طور معنی داری نسبت به گروه کنترل کاهش یافت (05/0p<) میزان IgM در تیمار 17-بتااسترادیول (2 میکروگرم در گرم) اختلاف معنی داری نسبت به تیمارهای نونیل فنل و گروه کنترل داشت. همچنین میزان IgM در گروه کنترل 1 (نمونه برداری در روز 21)، افزایش معنی داری در مقایسه با گروه کنترل صفر (نمونه برداری در ابتدای دوره) پیدا کرد (05/0p<). نتایج این تحقیق نشان داد، که نونیل فنل اتوکسیلات هم در غلظت های پایین و هم در غلظت های بالا اثرات قابل توجهی تولید ویتلوژنین پلاسما و تغییرات سطوح IgM و لیزوزیم داشته است.

دستورالعمل فنی و توصیه ترویجی :

- استفاده از شواهدی نظیر ویتلوژنین برای بررسی تاثیر پذیری آبزیان پرورشی از مخرب های هورمونی

- استفاده از شواهدی نظیر شاخص های ایمنی ماهی برای بررسی تاثیر پذیری آبزیان پرورشی از مخرب های هورمونی

ویژگی مناطق کاربرد توصیه ترویجی :

تکثیر کنندگان ماهیان گرم آبی در نواحی محتلف اقلیم کشور و کلیه مراکز دانشگاهی و تحقیقاتی

سازمان حفاظت محیط زیست

گزارش پروژه
مشخصات پیمانکار
مشخصات همکاران
اهداف طرح
زمانبندی طرح
روش تحقیق و اجرا
اطلاعات جغرافیایی
هزینه های اجرای پروژه
نتایج